Năm 363, khi mẫu thân của Ai Đế là Chu Thái phi qua đời, Tư Mã Dục trở thành người nhiếp chính trong giai đoạn ba tháng tang lễ.

Năm 364, Ai Đế, người bị việc trường sinh bất lão ám ảnh, đã bị các pháp sư đầu độc bằng thuốc, sau đó Hoàng đế đã không thể xử lý các vẫn đề quan trọng của đất nước. Trử Thái hậu một lần nữa trở thành người nhiếp chính, song các quyết định quan trọng do Tư Mã Dục và Hoàn Ôn đưa ra. Năm 365, người nhiếp chính của Tiền Yên là Mộ Dung Khác (慕容恪) bao vây thành Lạc Dương, Tư Mã Dục và Hoàn Ôn đã thảo luận về một cuộc phản công để giải vây cho Lạc Dương, song khi Ai Đế băng hà vào mùa xuân năm 365, kế hoạch đã bị hủy bỏ. Kế vị Ai Đế là em trai Lang Da vương Tư Mã Dịch. Tư Mã Dục tiếp tục giữ vai trò thừa tướng.